PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Tanggal Percobaan: 12 maret 2010

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM SAMPEL

DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

A. Tujuan

1. Mamahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif

2. Melakukan preparasi dengan tepat dan akurat serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC

3. Menentukan kadar parasetamol dalam sampel obat dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

B. Tinjauan Pustaka

Kromatografi merupakan metode pemisahan komponen-komponen campuran yang didasarkan atas distribusi differensial komponen sampel diantara 2 fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. HPLC (kromatografi cair kinerja tinggi) merupakan salah satu teknik kromatografi yan didasarkan pada perbedaan distibusi molekul-molekul komponen di antara dua fasa (fasa gerak dan fasa diam) yang berbeda kepolarannya. Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair yan dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan, pengidentifikasian, maupun analisis kuantitatif yang didasarkan pada pengukuran luas puncak analit dalam kromatogram yang dibandingkan dengan luas area standar. Untuk mendapatkan data yang akurat, maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.

Pada percobaan kali ini, yang akan dilakukan adalah penentuan kadar parasetamol dalam sampel dengan metode HPLC. Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti air atau metanol. (Wiji dkk,2009:11)

Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesik dan antipiretik yang populer dan digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam. Digunakan dalam sebagian besar resep obat analgesik salesma dan flu. Paracetamol aman dalam dosis standar, tetapi karena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak sengaja sering terjadi.

Berbeda dengan obat analgesik yang lain seperti aspirin dan ibuprofen, parasetamol tidak memiliki sifat antiradang. Jadi parasetamol tidak tergolong dalam obat jenis NSAID. Dalam dosis normal, parasetamol tidak menyakiti permukaan dalam perut atau mengganggu gumpalan darah, ginjal atau duktus arteriosus pada janin.

Paracetamol atau Asetaminofen atau N-Acetyl-para-aminophenol memiliki berat molekul 151,17 g/mol, rumus empiris C8H9NO2, titik leleh 169°C-170,5°C, larut dalam etanol, metanol dan etil asetat, larut dalam air dingin, bersifat polar karena adanya cincin benzen, nitrogen, amida, dan gugus OH.

Struktur paracetamol:

(sumber: http://en.wikipedia.org/wiki/parasetamol)

HPLC adalah bentuk kromatografi kolom yang sering digunakan dalam biokimia dan kimia analitik yang memanfaatkan perbedaan jenis fasa diam (khususnya rantai karbon jenuh hidrofobik). Instrumentasi HPLC terdiri dari fasa gerak, pompa, sistem penginjeksian sampel, kolom, detektor dan rekorder.

Diagram kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC adalah sebagai berikut:

(Hendayana, S, 2006:69)

1. Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Sifat-sifat yang diperlukan oleh fasa gerak adalah:

a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.

b. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.

c. Zat cair harus jernih untuk menghindari penyumbatan pada kolom.

d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

e. Zat cair tidak kental.

f. Sesuai dengan detektor.

Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan: (a) menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/ins²); (b) keluaran bebas pulsa; (c) kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit; (d) bahan tahan korosi; (e) dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kekurangan yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

Fasa gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara, yaitu:

a. Isokratik: aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fasa gerak tetap berlaku.

b. Gradient elution: aliran konstan dan perubahan komposisi dari fasa gerak terjadi. Mode gradien memberikan pemisahan yang lebih sempurna daripada mode isokratik.

c. Flow program: aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fasa gerak terjadi.

(Wiryawan, A., 2008:253)

2. Pemasukan cuplikan

Sampel yang dapat diamati dengan HPLC memiliki beberapa persyaratan, yaitu: a). Senyawa-senyawa ionik; b). Senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan mengalami peruraian); c). Senyawa-senyawa dengan massa molekul yang besar.

Cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh μL. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Beberapa teknik pemasukkan cuplikan ke dalam sistem HPLC yaitu injeksi syringe, injeksi stop flow, dan kran cupikan.

Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak melalui dua langkah: 1) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop. 2) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak melalui kolom.

3. Kolom

Kolom merupakan tempat berlangsungnya pemisahan komponen campuran. Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari geals berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjaidnya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya, kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparasi. Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colectur. Kolom utama berisi fasa diam berupa cairan sukar menguap dan stabil, misalnya C-18.

Selain kolom utama, dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang terbawa dalam fasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan.

4. Detektor

Alat ini mendeteksi komponen-komponen yang meninggalkan kolom. Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut, detektor spesifik memberi rewspon terhadap beberapa sifa solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap solut, setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Ada beberapa contoh detektor HPLC, diantaranya detektor UV, detektor elektrokimia, dan detektor fluorometrik.

Persyaratan detektor HPLC :

a. Sensitif

b. Stabilitas dan keterulangan tinggi

c. Respon linear terhadap solut

d. Waktu respon pendek sehingga tidak tergantung kecepatan alir

5. Recorder (komputer dan Printer)

Hasil percobaan akan dicetak dalam bentuk kromatogram yang terlihat oleh komputer. Kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakuakan dengan cara membandingkan waktu retensi (Tr) analit/sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan didasarkan pada luas area peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.

Adapun kelebihan penggunaan HPLC adalah:

a. Dapat menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada suhu tinggi karena dilakukan pada suhu kamar.

b. Dapat menganalisis cuplikan-cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.

c. Dapat menganalisis cuplikan yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didih sangat tinggi seperti polimer.

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Kurang cocok untuk sampel yang berupa gas

b. Mahal

Konsentrasi solut dalam setiap fasa dinyatakan sebagai koefisien pastisi, K

C_s dan C_m adalah konsentrasi solut dalam fasa diam dan fasa gerak.

Cara Pengoperasian:

Cuplikan dimasukkan kedalam aliran fasa gerak. Gerakan analit bergantung pada interaksi dengan fasa diam saat analit/cuplikan melewati kolom. Banyaknya analit yang mengalir dalam kolom bergantung pada sifat analit itu sendiri dan komposisi dari fasa gerak dan fasa diam. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran yang disebabkan perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu.

Waktu retensi merupakan waktu khusus untuk analit mengelusi atau keluar dari ujung kolom. Waktu retensi memberikan keterangan yang khas untuk mengidentifikasi karakteristik yang diberikan oleh cuplikan. Untuk mempersingkat waktu difusi komponen didalam kolom, maka ukuran partikel haruslah kecil (membuat tekanan lebih tinggi) sehingga meningkatkan laju linear dan meningkatkan penyelesaian hasil kromatogram.

Fasa gerak atau pelarut yang digunakan mengandung beberapa kombinasi yang saling melarutkan seperti air dan pelarut organik (metanol dan asetonitril). Air mengandung penyangga atau garam yang dapat memisahkan komponen analit seperti asam trifloroasetat yang bertindak sebagai agen ion pasangan. Selain itu, ada juga istilah gradien elusi yang berarti perbaikan untuk HPLC dengan menngubah komposisi fasa gerak pada saat analisis. Gradien normal dimulai pada 5% metanol – 50% mrtanol diatas 25 menit. Gradien dipilih berdasarkan sifat hidrofobik suatu analit. Gradien memisahkan campuran analit sebagai fungsi dari afinitas analit dalam fasa gerak yang berkompetisi relatif terhadap fasa diam. Pada contoh ini, penggunaan air atau metanol, komponen yang lebih hidrofobik akan mengelusi saat fasa gerak yang mengandung lebih banyak metanol. Senyawa yang lebih hidrofobik akan terelusi berdasar kondisi relatif metanol atau air tinggi.

Pemilihan pelarut, bahan tambahan dan gradien didasarkan pada sifat fasa diam dan analit. Seringkali serangkaian pengujian dilakukan pada analit dan sejumlah percobaan mungkin dilakukan hingga ditemukan metode HPLC yang memberikan puncak pemisahan terbaik.

Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor, kemudian direkam dalam bentuk kromatogram seperti pada kromatografi gas. Jumlah puncak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas area puncak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

Jenis-jenis HPLC:

1. Kromatografi adsorbsi

Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan senyawa-senyawa yang agak polar. Pertikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Gugus-gugus polar silanol pada permukaan silika dan gugus polar aluminol pada permukaan alumina bertindak sebagai tempat adsorbsi molekul-molekul polar. Jenis kromatografi ini menggunaka fasa gerak nonpolar seperti heksana dan jenis kromatografi ini disebut juga kromatografi fasa normal.

2. Kromatografi partisi

Pada kromatografi partisi, retensi solut dan pemisahan analog dengan ekstraksi cair-cair. Konsentrasi solut dalam masing-masing fasa cair sinyatakan dengan koefisien partisi. Biasanya fasa gerak lebih polar daripada fasa diam sehingga disebut kromatografi fasa terbalik.

3. Kromatografi fasa terikat

Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang paling penting dan paling banyak digunakan pada saat sekarang. Kromatografi fasa terikat dioperasikan dengan mode fasa terbalik. Akan tetapi, sorben fasa terikat terdidi dari partikel silika akan dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil.

4. Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan campuran ion-ion atau molekul-molekul yang dapat di-ionkan. Ion-ion bersaing dengan ion fasa gerak untuk memperebutkan tempat berikatan pada fasa diam.

5. Kromatografi ekslusi ukuran

Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan kromatografi ekslusi ukuran. Teknik ini berbeda dengan teknik-teknik kromatografi lainnya karena disini hampir tidak ada fasa diam. Interaksi polar dan non-polar diantara solut dan fasa diam pada dasarnya tidak diharapkan karena hal itu mempersulit retensi. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar pori-pori material paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah volume tereklusi. Sebaliknya, molekul-molekul kecil menempati volume pori dan bertahan lebih lama.

C. Alat Dan Bahan

1. Alat-alat :

· Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) 1 set

· Lumpang dan alu 1 buah

· Spatula 1 set

· Labu takar 25 mL dan 10 mL 7 buah

· Neraca analitik 1 set

· Corong pendek 1 buah

· Pipet tetes 5 buah

· Gelas kimia 5 mL 1 buah

· Gelas ukur 10 mL 1 buah

· Ultrasonic Vibrator 1 set

2. Bahan:

· Standar parasetamol 6,25 mg

· Metanol 375 mL

· Sampel obat 6 butir

· Aquades secukupnya

· Membran PTFE 1 set

· Selulosa nitrat 1 set

· Kertas saring secukupnya

D. Prosedur Kerja

1. Pembuatan pelarut dan fasa gerak

Metanol disaring dengan PTFE dan air disaring dengan selulosa nitrat. Lalu dicampur masing-masing dengan perbandingan 75:25 dengan volume total sebanyak 500 mL.

2. Pembuatan larutan induk parasetamol

Sebanyak 6,25 mg parasetamol ditimbang dengan neraca analitik dalam botol timbang. Parasetamol tersebut dilarutkan dengan sedikit pelarut, dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL. Setelah itu, dihomogenkan dan ditambahkan pelarut sampai tanda batas.

3. Pembuatan larutan standar parasetamol

Larutan induk parasetamol masing-masing dipipet sebanyak 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL dan 5 mL yang masing-masing dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Setelah itu ditambahkan pelarut masing-masing sebanyak 5 mL dan dihomogenkan. Kemudian ditambah lagi pelarut sampai tanda batas. Selanjutnya disaring dengan PTFE dan disimpan dalam botol vial lalu didegassing.

4. Pembuatan larutan sampel parasetamol

Sebanyak 6 tablet obat sampel masing-masing ditimbang beratnya dan dihitung berat rata-ratanya. Tablet obat tersebut digerus dalam mortar hingga halus dan ditimbang serbuknya sebanyak 27 mg dengan neraca analitik dalam botol timbang. Kemudian dilarutkan dengan sedikit pelarut dan dipindahkan ke dalam labu ukur 25 mL, sampel dihomogenkan dalam ultrasonic vibrator. Setelah itu ditambahkan pelarut hingga tanda batas.

Larutan sampel tersebut kemudian disaring dan ditampung dalam labu erlenmeyer. Kemudian dipipet sebanyak 1 mL dan disimpan dalam labu ukur 10 mL yang diencerkan dengan pelarut sampai tanda batas. Larutan sampel teresbut disaring kembali menggunakan membran PTFE dan filtratnya didegassing selama 5 menit. Setelah itu, sampel siap untuk diinjeksikan.

5. Prosedur HPLC

Alat dan eluen yang akan digunakan dikondisikan sehingga setimbang +/- 30 menit. Kelima standar parasetamol diinjeksikan, diikuti dengan sampel yang diinjeksikan sebanyak 2 kali pengulangan. Rata-rata area sampel dihitung dan kadar parasetamol dalam sampel ditentukan dengan metode kurva kalibrasi.

E. Hasil dan Analisis Data

Pada percobaan penentuan kadar parasetamol dalam sampel obat menggunakan kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC) ini menggunakan fasa gerak metanol dan air dengan komposisi 75:25. Fasa gerak dalam HPLC ini selain berfungsi sebagai pelarut, juga bersifat interaktif sehingga bisa berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Fasa gerak dalam hal ini bertindak sebagai pelarut sangat mempengaruhi waktu retensi, sehingga pelarut yang digunakan harus benar-benar jernih dan murni. Oleh sebab itu, metanol dan air terlebih dahulu disaring.

Dalam pembuatan larutan induk parasetamol, pembuatannya harus dilakukan dalam satu kali pengerjaan, artinya untuk membuat larutan standar parasetamol dan untuk keperluan pengenceran sampel harus menggunakan larutan induk parasetamol yang sama. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga agar peak yang ditunjukkan kromatogram sampel memungkinkan masih berada dalam rentang konsentrasi larutan standar yang dibuat.

Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar parasetamol maupun sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur sempurna (merata). Larutan standar dan sampel juga harus didegassing untuk menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat mengganggu baseline pada kromatogram, sehingga peak yang dihasilkan tidak sesuai.

Akibat perbedaan interaksi antara solut dengan fasa gerak dan fasa diam yang terjadi mulai dari kolom sampai terdeteksi oleh detektor, maka hasil yang diperoleh adalah dalam bentuk kromatogram yang diperlihatkan oleh rekorder. Deret larutan standar yang dibuat mulai dari konsentrasi 25, 50, 75, 100 dan 125 ppm

Berikut tabel data deret larutan standar yang diperoleh:

Konsentrasi (ppm)	Luas Area	Waktu retensi
25	2488335	1,51
50	4126411	1,50
75	6744285	1,51
100	8901360	1,51
125	10667748	1,51

Analisis terhadap cuplikan atau sampel obat dilakukan setelah semua deret larutan standar telah dianalisis. Sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali injeksi untuk memperoleh luas area rata-rata yang nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar parasetamol yang terdapat dalam sampel obat tersebut.

Berikut tabel data sampel yang diperoleh:

Data Sampel
Penginjeksian 1	Waktu Retensi (min)	Area
Peak 1	1,51	7762424
Peak 2	2,31	13143
Penginjeksian 2
Peak 1	0,06	7100
Peak 2	0,26	57665
Peak 3	1,51	7777816
Peak 4	2,30	6844

Kromatogram sampel yang diperoleh dari masing-masing penginjeksian menunjukkan adanya 2 peak dan 4 peak. Hal tersebut dikarenakan kandungan dalam sampel obat tidak hanya mengandung parasetamol saja, tetapi juga mengandung bahan lain seperti propanezon, deklorfenilamina maleat dan kafein, sehingga peak lainnya yang ditunjukkan dalam kromatogram adalah bahan lain yang terkandung dalam sampel obat tersebut. Peak yang dianggap sebagai peak parasetamol adalah peak yang pertama (penginjeksian pertama) dan peak yang ketiga (penginjeksian kedua) karena dilihat dari waktu retensi yang sama atau hampir sama dengan waktu retensi deret larutan standar.

Untuk menentukan kadar parasetamol yang terkandung dalam sampel obat tersebut, maka dibuat terlebih dahulu kurva kalibrasi dari data deret larutan standar. Berikut kurva kalibrasi deret larutan standar yang diperoleh:

Dari kurva kalibrasi tersebut, diperoleh persamaan garis y = 84535x + 24549, sehingga setelah dilakukan perhitungan menggunakan persamaan garis, maka kadar parasetamol dalam sampel adalah 84,837% dalam 27 mg sampel obat.

F. Kesimpulan

Berdasarkan percobaan, diperoleh kadar parasetamol dalam 27 mg sampel obat sebesar 84,837%.

G. Daftar Pustaka

Hendayana, S. (1994). Kimia Analitik Instrumen. Bandung: IKIP Semarang Press

Hendayana, S. (2006). Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya

Tim Kimia Analitik Instrumen. (2009). Penuntun Praktikum Kimia Analitik Instrumen. Bandung: Jurusan Pendidikan Kimia FPMIPA UPI

http://en.wikipedia.org/wiki/parasetamol)

H. Lampiran

1. Perhitungan

a. Konsentrasi larutan induk parasetamol