METODE HPLC UNTUK PENENTUAN AMOKSISILIN TRIHIDRAT DAN BROMHEKSIN HIDROKLORIDA DALAM BENTUK DOSIS ORAL
Seminar Kimia Analitik
oleh: Yaktiva Dwi Purnama
BAB I
PENDAHULUAN
Amoksisilin dan Bromheksindigunakan secara klinis untuk pengobatan penyakit akut dari bronkitis kronis. Survei mengungkapkan bahwa Amoksisilin Trihidrate biasanya ditentukan menggunakan Spectrophotometry, HPLC, HPLC dengan Fluorimetric detection, HPLC dengan array dioda foto detection dan voltametry.
Bromheksin hidroklorida (Brom) digunakan dalam pengobatan gangguan pernapasan terkait dengan batuk produktif. Hal ini biasanya ditentukan dengan teknik yang sedikit berbeda, sepertispectrophotometry, HPLC, kolorimetri, TLC, flow-injeksi-spectrophotometry, GC, ion-elektroda selektif (ISE), analisis linear hybrid, kapiler isotachophoresis, spektrofotometri serapan dan electrophoresis. Obat-obatan ini telah dianalisis dengan banyak metode, namun hanya metode HPLC microbore yang dilaporkan untuk kombinasi kedua obat ini dengan menggunakan Spherisorb,kolom CN Microbore (150mm × 2mm) dan fasa gerak 20% Acetonitrile.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam sampel di berbagai bidang, antara lain farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri– industri makanan.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa–senyawa tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul–molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa–senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa–senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif (merusak) dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa–senyawa tertentu seperti asam–asam amino, asam–asam nukleat, dan protein– protein dalam cairan fisiologis; menentukan kadar senyawa–senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk–produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel–sampel yang berasal dari lingkungan; memurnikan senyawa dalam suatu campuran; memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran; kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.
Fase gerak atau eluen merupakan komponen penting dalam HPLC yang biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen–komponen sampel. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah–ubah selama elusi) (Rohman, 2007).
BAB II
ISI
ISI
METODE HPLC UNTUK PENENTUAN AMOKSISILIN TRIHIDRAT DAN BROMHEKSIN HIDROKLORIDA DALAM BENTUK DOSIS ORAL
2.1 DASAR TEORI
2.1.1 HPLC
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran. Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan diantara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Pemisahan dengan kromatografi didasarkan pada perbedaan kesetimbangan diantara komponen-komponen campuran diantara fasa gerak (fasa mobil) dan fasa diam. Kesetimbangan ini dapat dijelasakan secara kuantitatif dengan istilah koefisien partisi, K, yang untuk kromatografi dirumuskan sebagai:
 |
dengan Cs menyatakan konsentrasi solut dalam fasa diam dan CM menyatakan konsentrasi solut dalam fasa gerak. (Hendayana, S, 2006:73)
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaanyang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah kromatografi dengan zat cair sebagai fasa gerak dan fasa diam. Dalam kromatografi cair (HPLC) kedudukan gas diganti oleh zat cair yang bertekanan tinggi (Hendayana, S, 1994:251). Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solut melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya, dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, HPLC dikelompokkan atas HPLC fasa normal dan fasa terbalik. HPLC dengan kombinasi fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut HPLC fasa normal. HPLC fasa normal tidak dapat diterapkan pada cuplikan yang bersifat polar. Untuk memisahkan cuplikan yang bersifat polar maka kombinasi fasa gerak dan fasa diam harus dibalik, yaitu fasa diam non polar dikenal dengan istilah HPLC fasa terbalik. (Hendayana, S, 2006:83-85)
Dalam HPLC, zat cair digunakan sebagai fasa gerak. Sebagai akibat penggunaaan fasa gerak zat cair maka sangat sukar zat cair mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara cepat maka dibutuhkan bantuan pompa bertekanan tinggi.
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi dengan oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah komponen sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. (Hendayana, S, 2006:83-85)
Diagram kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC adalah sebagai berikut.
Instrumentasi kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC adalah sebagai berikut:
1. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut.
Persyaratan fasa gerak HPLC yaitu:
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
b. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
c. Zat cair harus jernih untuk menghindari penyumbatan pada kolom.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
e. Zat cair tidak kental.
f. Sesuai dengan detektor.
Berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, HPLC dikelompokkan atas HPLC fasa normal dan HPLC fasa terbalik. HPLC fasa normal memiliki fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. Sedangkan HPLC fasa terbalik mengkombinasikan fasa diam non-polar dan fasa gerak polar.
2. Pompa (pump)
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus.
Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan yaitu menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/ins2), keluaran bebas pulsa, kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit, bahan tahan korosi,dan dapat mengalirkan fasa gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. Ada tiga tipe pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kekurangannya yaitu:
a. Pompa reciprocating
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu dibutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadap aliran. Keuntungannya adalah ukuran reservoir tidak terbatas.
b. Pompa Displacement
Pompa ini menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan balik kolom dan visikositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250mL) dan tidak mudah untuk melakukan penggantian pelarut.
c. Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekenanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada visikositas pelarut dan tekanan balik kolom.
Fasa gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara, yaitu:
a. Isokratik: aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fasa gerak tetap berlaku.
b. Gradient elution: aliran konstan dan perubahan komposisi dari fasa gerak terjadi. Mode gradien memberikan pemisahan yang lebih sempurna daripada mode isokratik.
c. Flow program: aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fasa gerak terjadi.
(Wiryawan, A., 2008:253)
3. Pemasukan cuplikan
Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
Sampel yang dapat diamati dengan HPLC memiliki beberapa persyaratan yaitu senyawa-senyawa ionik, senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan mengalami peruraian), dan senyawa-senyawa dengan massa molekul yang besar. Cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh μL. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Beberapa teknik pemasukkan cuplikan ke dalam sistem HPLC yaitu injeksi syringe, injeksi stop flow, dan kran cupikan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak melalui dua langkah: 1) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop. 2) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak melalui kolom.
4. Kolom
Kolom merupakan tempat berlangsungnya pemisahan komponen campuran. Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari geals berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjaidnya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya, kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparasi.
a. Kolom analitik
Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Umtuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang berukuran 5 cm.
b. Kolom preparatif
Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dengan panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (LSC, LLC, IEC atau EC). Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colectur. Kolom utama berisi fasa diam berupa cairan sukar menguap dan stabil, misalnya C-18.
Selain kolom utama, dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang terbawa dalam fasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan.
5. Detektor
Alat ini mendeteksi komponen-komponen yang meninggalkan kolom. Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut, detektor spesifik memberi rewspon terhadap beberapa sifa solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap solut, setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Ada beberapa contoh detektor HPLC, diantaranya detektor UV, detektor elektrokimia, dan detektor fluorometrik.
Adapun persyaratan detektor HPLC :
a. Sensitif
b. Stabilitas dan keterulangan tinggi
c. Respon linear terhadap solut
d. Waktu respon pendek sehingga tidak tergantung kecepatan alir
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC antara lain:
6. Recorder (komputer dan Printer)
Hasil percobaan akan dicetak dalam bentuk kromatogram yang terlihat oleh komputer. Kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakuakan dengan cara membandingkan waktu retensi (Tr) analit/sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan didasarkan pada luas area peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.
Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan penampilan tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber,yang bekerja pada tekanan sampai 2,07x107Nm-2 (3000 psi). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal. HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik. Pengembangan penerapan dalam anorganik menjadi mungkin, misalnya dalam bidang kromatografi pertukaran ion di mana telah tersedia dipasar dengan nama dagang ‘Zipax’ resin peliklar, yakni resin yang dihasilkan dalam bentuk saluran tipis pada permukaan manik kaca yang blat (diameter 2050 mikrometer). Manik-manik itu mempunyai permukaan berpori yang tebalnya 2 mikrometer yang berperan sebagai pengikat saluran resin itu (Bassett et. all., 1994).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensiyang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerakyang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 m; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekananyang tinggi (Khopkar, 2003).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
Selain itu, kelebihan HPLC antara lain:
a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
b. Mudah melaksanakannya
c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang dianalisis
e. Resolusi yang baik
f. Dapat digunakan macam-macam detektor
g. Kolom dapat digunakan kembali
2.1.2 Amoksisilin Trihidrat
Amoksisilina Trihidrat memiliki rumus molekul C16H19N3O5S.3H2O, berat molekul 419,45 dan 365,9 dalam bentuk anhidrat. Amoksisilina Trihidrat berupa serbuk hablur, putih, tidak berbau, sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut dalam benzen, karbon tetraklorida dan dalam kloroform.
Amoxicillin mempunyai nama generik Amoxicillin dengan nama paten yang jumlahnya mencapai ratusan buah. Penmox, Intermoxyl, Ospamox, Amoxsan, Hufanoxyl, Yusimox merupakan beberapa nama dagang atau nama paten dari antibiotika ini.
Amoxicillin adalah antibiotika yang termasuk ke dalam golongan penisilin. Obat lain yang termasuk ke dalam golongan ini antara lain Ampicillin, Piperacillin, Ticarcillin, dan lain lain. Karena berada dalam satu golongan maka semua obat tersebut mempunyai mekanisme kerja yang mirip. Obat ini tidak membunuh bakteri secara langsung tetapi dengan cara mencegah bakteri membentuk semacam lapisan yang melekat disekujur tubuhnya. Lapisan ini bagi bakteri berfungsi sangat vital yaitu untuk melindungi bakteri dari perubahan lingkungan dan menjaga agar tubuh bakteri tidak tercerai berai. Bakteri tidak akan mampu bertahan hidup tanpa adanya lapisan ini.
Amoksisilin mempunyai spektrum antibiotik serupa dengan ampisilin. Beberapa keuntungan amoksisilin dibanding ampisilin adalah absorbsi obat dalam saluran cerna lebih sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih tinggi. Efek terhadap Bacillus dysentery amoksisilin lebih rendah dibanding ampisilin karena lebih banyak obat yang diabsorbsi oleh saluran cerna (Siswandono, 2000).
Amoksisilin merupakan turunan dari penisilin yang stabil dalam suasana asam lambung. Amoksisilin diabsorpsi dengan cepat dan baik pada saluran pencernaan, tidak tergantung adanya makanan. Amoksisilin terutama diekskresikan dalam bentuk tidak berubah di dalam urin. Ekskresi Amoksisilin dihambat saat pemberian bersamaan dengan probenesid sehingga memperpanjang efek terapi (Siswandono, 2000).
Namun, resistensi terhadap amoksisilin dan ampisilin merupakan suatu masalah, karena adanya inaktifasi oleh plasmid yang diperantai penisilinase. Pembentukan dengan penghambat β–laktamase seperti asam klavunat atau sulbaktam melindungi amoksisilin atau ampisilin dari hidrolisis enzimatik dan meningkatkan spektrum antimikrobanya (Mycek, 2001).
Amoksisilin adalah antibiotik dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan seperti untuk infeksi pada saluran napas, saluran empedu, dan saluran seni, gonorhu, gastroenteris, meningitis dan infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid. Amoxicillin adalah turunan penisilin yang tahan asam tetapi tidak tahan terhadap penisilinase (Siswandono, 2000).
Amoksisilin digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri Gram-negatif seperti Haemophilus Influenza, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella. Amoksisilin juga dapat digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri Gram-positif seperti: Streptococcus pneumoniae, enterococci, nonpenicilinase-producing staphylococci, Listeria. Amoksisilin diindikasikan untuk infeksi saluran pernapasan, infeksi saluran kemih, infeksi klamidia, sinusitis, bronkitis, pneumonia, abses gigi dan infeksi rongga mulut lainnya (Siswandono, 2000).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warnakristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Disisi lain, bakteri Gram-positif akan berwarna ungu. Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri. Bakteri Gram-positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang.Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
Amoksisilin aktif melawan bakteri Gram positif yang tidak menghasilkan β-laktamase dan aktif melawan bakteri gram negatif karena obat tersebut dapat menembus pori–pori dalam membran fosfolipid luar. Untuk pemberian oral, amoksisilin merupakan obat pilihan karena di absorbsi lebih baik daripada ampisilin, yang seharusnya diberikan secara parenteral (Neal, 2007).
Berikut ini adalah karakteristik dari bakteri Gram positif dan negatif:
| Karakteristik | Gram Positif | Gram Negatif |
| Dinding Sel | Homogen dan tebal (20-80 nm0 serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel. | Peptidoglikan (2-7nm) di antara membran dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida |
| Bentuk Sel | Bulat, batang atau filamen | Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tanda koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul |
| Reproduksi | Pembelahan biner | Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan |
| Metabolisme | kemoorganoheterotrof | Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof |
| Motilitas | Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous) | Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous). |
| Anggota Tubuh (Apendase) | Biasanya tidak memiliki apendase | Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai |
| Endospora | Beberapa grup dapat membentuk endspora | Tidak dapat membentuk endospora |
Sesuai dengan mekanisme kerja diatas maka Amoxicillin seharusnya memang digunakan untuk mengobati penyakit penyakit yang disebabkan oleh kuman kuman yang sensitif terhadap Amoxicillin. Beberapa penyakit yang biasa diobati dengan Amoxicillin antara lain infeksi pada telinga tengah, radang tonsil, radang tenggorokan, radang pada laring, bronchitis, pneumonia, infeksi saluran kemih, dan infeksi pada kulit. Amoxicillin juga bisa digunakan untuk mengobati gonorrhea.
Obat ini tersedia di pasaran dalam bentuk Kapsul : 250 dan 500 mg. Tablet : 500 mg. Sirop kering : 125mg/5ml dan 250mg/5ml. Vial untuk injeksi : 1000mg dan 500mg.
Dosis therapi untuk Amoxicillin pada orang dewasa adalah 250 mg setiap 8 jam, 500 mg setiap 8 jam, 500 mg setiap 12 jam, terggantung dari derajat keparahan dari penyakit yang di derita. Untuk pengobatan gonorrhea pada orang dewasa, diberikan Amoxicillin sebanyak 3 g sekali minum. Dosis untuk anak anak diatas 3 bulan adalah 25 mg/kg/hari terbagi setiap 12 jam, 20 mg/kg/hari terbagi setiap 8 jam, 40 mg/kg/hari terbagi setiap 8 jam atau 45 mg/kg/hari terbagi dalam 12 jam terggantung dari derajat keparahan penyakit.
Struktur dari amoksisilina trihidrat
Dosis amoksisilina juga disesuaikan dengan berat badan pasien, yaitu:
ü Anak dengan berat badan kurang dari 20 kg: 20 – 40 mg/kg berat badan sehari, terbagi dalam 3 dosis.
ü Dewasa atau anak dengan berat badan lebih dari 20 kg: 250 – 500 mg sehari, sebelum makan.
2.1.3 Bromheksin HCL
Sedikitnya dikenal tiga golongan obat untuk mengatasi batuk. Pertama ialah antitusif yang menekan refleks batuk, Kodein merupakan contohnya. Golongan kedua disebut ekspektoran. Ini merangsang sekresi sputum dari saluran nafas, disamping kadang-kadang bersifat merangsang muntah (emetik). Yodium dan amonium khlorida dalam Obat Batuk Hitam (OBH) merupakan contohnya. Belakangan ini sering digunakan gliseril guaiakolat sebagai ekspektoran. Tapi meskipun penderita telah dirangsang dengan ekspektoran, sputum kadang-kadang masih sulit dikeluarkan dari saluran nafas. Maka dicarilah obat lain, golongan mukolitik. Obat golongan ini menghancurkan atau mengencerkan sputum sehingga mudah dikeluarkan. Beberapa zat mukolitik diantaranya air, chymotrypsin dan enzim-enzim lain, asetilsistein dan metilsistein dan bromhexin. Tingginya kekentalan sputum pada penderita asma atau bronkhitis kronis misalnya, disebabkan oleh dua jenis jaringan benang dalam sputum, yaitu benang-benang DNA (deoxyribonucleic acid), dan benang muko polisakrida. Benang DNA hanya ada dalam sputum yang purulen, karena ini berasal dari inti sel-sel mukosa yang hancur. Sedangkan benang-benang muko polisakarida banyak ditemukan pada sputum yang mukoid. Benang jenis kedua ini sedikit ditemukan dalam sputum yang purulen karena telah dihancurkan oleh enzim-enzim bakteri. Dengan terapi antibiotika yang efektif, kerusakan mukosa dapat dicegah, sehingga benang-benang DNA akan makin sedikit. Tapi ternyata saat itu sputum masih kental karena benang-benang mukopolisakarida muncul kembali. Bromhexin bekerja dengan cara menghancurkan benang-benang mukopolisakarida itu menjadi fragmen-fragmen kecil, sehingga sputum menjadi encer. Selain itu, dengan penyelidikan mikroskop elektron diketahui bahwa bromhexin juga menyebabkan perubahan pada granula pada kelenjar-kelenjar penghasil mukus di mukosa bronkhial dan hidung.
Bromheksin adalah agen mucolyticyang digunakan dalam pengobatan gangguan pernapasan terkait dengan lendir kental atau berlebihan. Selain itu, bromheksin memiliki sifat antioksidan.FungsiBromheksin mendukung mekanisme sendiri alami tubuh untuk membersihkan lendir dari saluran pernapasan. Zat ini adalah turunan sintetik dari vasicine, suatu alkaloid yang berasal dari tumbuhan Adhatoda vasica yang berasal dari India. Bromheksin diakui sebagai obat yang punya khasiat spesifik terhadap sputum dan bermanfaat dalam klinik. Kini obat ini banyak dipakai untuk berbagai penyakit saluran pernafasan.
Keuntungan lain dari penggunaan bromheksin ialah dapat meningkatkan kadar tetrasikin/oksitetrasiklin dalam sekret bronkhial. Maka kombinasi antibiotika ini denganbromheksin dilaporkan lebih efektif daripada tetrasiklin saja. Pada penderita yang gawat bromheksin dapat diberikan secara parenteral.Bila ada infeksi bakterial, antibiotika harus diberikan juga disamping bromheksin.Pemberian Bromheksin HCl bersamaan dengan antibiotika (Amoksisilin, Sefuroksim, Doksisiklin) akan meningkatkan konsentrasi antibiotika dalam jaringan paru.
Bromheksin HCL memiliki nama 2-Amino-3.5-dibromobenzyl (cyclohexyl) methylamine hydrochloride dengan struktur C14H20Br2N2.HCl. Bromheksin HCL berbentuk serbuk kristal warna putih atau hampir putih, tidak larut dalam air, sedikit larut dalam alkohol dan kloroform.
Bromheksin bersifatsekretolitik (pengencer dahak), yaitu meningkatkan produksi lendir serosa dalam saluran pernafasan dan membuat dahak lebih tipis dan kurang lengket. Hal ini memberikan kontribusi untuk efek secretomotoric. Ini dapat membantu siliarambut kecil yang melapisi saluran pernapasan untuk transportasi dahak keluar dari paru-paru. Untuk alasan ini sering ditambahkan ke beberapa sirup antitusif.
Struktur Bromheksin HCL
Dosis Bromheksin
· Dosis oral untuk orang dewasa ialah 3 kali sehari 8 -16 mg.
· Dosis oral untuk anak-anak dibawah 5 tahun, 2 kali sehari 4 mg.
· Dosis oral untuk anak-anak 5 -10 tahun, 4 kali sehari 4 mg
2.2 PROSEDUR EKSPERIMEN
1. ALAT DAN BAHAN
Alat
a. Pompa PU2080 plus
b. Injeksi sampel 20 µl
c. Detektor UV 2075 plus
d. Komputer (Software Borwin versi 1,5)
e. Kolom C-18 (4,6 x 250 mm, 5µ)
f. pH delux 101
Bahan
a. Bromolin -250
b. Amonium Asetat
c. Orto asam fosfat
d. Metanol
e. Sil C18 (Octadecyl bonded silica)
2. LANGKAH KERJA
· Pembuatan Larutan stok standar
Masing-masing 10 mg Amox dan Brom diletakkan dalam 10 ml labu volumetrik terpisah dan dilarutkan dalam fasa gerak, volume dibuat sama dengan fasa gerak untuk mendapatkan konsentrasi akhir 1mg/ml.
· Pembuatan fasa gerak
Metanol (0,02M) dan Amonium asetat yang dijaga pada pH 5 dengan asam ortofosfat (aq) 10% (dengan perbandingan 90:10)disiapkan, disaring menggunakan membran filter 0,45 pM dan disonikasi pada ultrasonik bath.
· Pembuatan larutan untuk kurva kalibrasi
Larutan standar AMOX dibuat dengan berbagai jenis konsentrasi diantaranya konsentrasi 100, 150, 200, 250, 300 mg/ml. Larutan standar Brom diambil 1ml untuk diencerkan dengan 10 ml fase gerak. Larutan ini diencerkan lebih lanjut untuk mendapatkan larutandengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10 mg/ml.
· Prosedur untuk pembuatan larutan sampel atau analisis kapsul
Sampel yang digunakan adalah Bromolin-250. Tiap kapsul mengandung Amoksisilin Trihidrat yang setara dengan amoksisilin 250mg dan bromhexine Hidroklorida 8mg. Dua puluh Kapsul, masing-masing berisi AMOX 250mg dan 8mg Brom diambil isinya dan dihaluskan. 25 mg AMOX ditimbang dan dipindahkan ke 25 ml labu volumetrik. 20 ml fase gerak ditambahkan ke labu yang sama dan disonikasi selama 10 menit. Ditambahkan fasa gerak hingga memiliki volume 25ml. Larutan pertama kali disaring menggunakan kertas filter whatmann No. 41 dan kemudian dengan kertas saring 0,45μ untuk menghilangkan kotoran. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan menggunakan fasa gerakuntuk mendapatkan larutan125 mg/ml AMOX dan 4 ml/ml Brom. Lakukan hal yang sama hingga lima kali, kemudian disuntikkan ke dalam sistem.
· Pengenceran untuk presisi
Metode presisidilakukan oleh sistem presisi dan keterulangan. Dalam sistem presisi , campuran standar (berisi AMOX 125μg/ml dan Brom 4μg/ml) digunakan dengan 6 kali pengulangan. Sedangkan studi keterulangan dilakukan dengan menggunakan 3 macam tingkat konsentrasi. Untuk Intravariabilitas percobaan dilakukan dalam satu hari, sedangkan untuk Inter studi variabilitas dilakukan dalam 3 hariberturut-turut. Macam-macam konsentrasi yang digunakan untuk AMOX adalah 100µg/ml, 150µg/ml, 200 µg/ml dan untuk Brom adalah 2µg/ml, 4µg/ml, 6 µg/ml.
· Pengenceran untuk recovery
Untuk mengkaji keakuratan metode, studirecoverydilakukan dengan penambahan larutan standar adisiuntuk sampel pada 3 macam konsentrasi yang berbeda, 80%, 100% dan 120% dari konsentrasi-konsentrasi yang diuji (konsentrasi uji 125μg/ml untuk AMOX dan 4 μg/ml untuk Brom)
· Fluktuasi
Fluktuasidari metode ditentukan dengan sederhana, dengan mempertimbangkan perubahan laju alir, rasio fase gerak, panjang gelombang deteksi dan pH fase gerak. Laju alirdiubah menjadi 1±0,05 ml/menit. Rasio fasa gerak diubah menjadi ±1% untuk metanol, pH fase gerak diubah menjadi 5±0,1
· Penentuan LOD dan LOQ
Batas deteksi (LOD/Limid of detection) dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
LOD = 3,3 σ/S.
Batas kuantisasi(LOQ/Limit of Quantitation) dapat dihitung berdasarkan standar deviasi dari respon dan slope(kemiringan).
LOQ = 10 σ/S
Dimana σ = Standar deviasi dari respon
S = Kemiringan kurva kalibrasi
· Pengujian kecocokan sistem
Pengujian kecocokan sistem digunakan untuk memverifikasi bahwa resolusi dan reproduktifitas dari sistem memadai untukanalisis yang akan dilakukan. Parameter seperti pelat teoritis, faktor bagian akhir, resolusi ditentukan dan dibandingkan terhadap spesifikasi.
3. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Larutan Amoksisilin Trihidrat (AMOX) dan Bromheksin Hidroklorida (Brom) yang berkerja standar diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dan dijalankan dalam sistem pelarut (fasa gerak) yang berbeda. Fasa gerak yang berbeda mengandung metanol, buffer (Fosfat, amonium asetat) di berbagai perbandingandiujikan dengan perbandingan akhir Methanol (0.02M) :ammonium asetat yang pH nya disesuaikan menjadipH-5 dengan ortho asam fosfat (90:10) dipilih sebagai fasa gerak yang tepat dimana dapat memberikan resolusi yang baik dan puncak parameter dapat diterima untuk keduanya(AMOX dan Brom).
Dari pengenceran larutan stok standar lebih lanjut(AMOX 125 μg/ml dan Brom 4 µg/ml) dilakukanmenggunakan fase gerak dan diamati pada rentang 200-400 nm dan spektrumnya tumpang tindih. Padafaktanya, isi AMOX jauh lebih besar (125mg)dari Brom (4mg), dimana AMOXmenunjukkan absorbansi relatif rendah dibandingkan Brom. Hal itu teramati pada panjang gelombang 254nm, baik AMOX mupun Brom menunjukkan serapan yang cukup besar danAMOX menunjukkan absorbansi relatif rendah dibandingkanBrom sehingga dipilih sebagai pendeteksipanjang gelombang. Spektrum tumpang tindih dari kedua obat ditampilkanpada Gambar 1.
Gambar 1: spektra tumpang tindih dari AMOX dan Brom (masing-masing 10 mg/ml)
Keterangan:
= Brom = Amox
|
|
Gambar 2. Kurva Kalibrasi untuk AMOX
|
|
Tabel 1. Ringkasan kondisi kromatografi
| S No. | Parameter | Kondisi |
| 1 | Kolom | HiQ Silica C-18 (4.6 x 250mm, 5µm) |
| 2 | Fasa Gerak | Metanol 0,02M Amonium Asetat pH 5 (90:10) |
| 3 | Laju Alir | 1mL/menit |
| 4 | Panjang Gelombang Deteksi | 254 nm |
| 5 | Injeksi Sampel | 20µL putaran |
Validasi Metode
Linieritas antaraluas puncak dan konsentrasi dapat diamati selama rentang 100-300 µg/ml untuk AMOX dan 2-10 µg/ml untuk Brom. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi, yang mana untuk AMOX 0,993 dan 0,995 untuk Brom.Koefisien korelasi, y-intercept,kemiringan regresi ditunjukkan pada Gambar 2 dan 4.
Presisi dilakukan sebagai sistem presisi dan keterulangan sebagai pedoman ICH. Hal itu ditentukan pada 3 tingkat konsentrasi dengan 3 kali pengulangan pada setiap tingkat. Dari ketiga tingkat konsentrasi tersebut, % RSD diperoleh kurang dari 2% untuk kedua obat. Hasil presisi diberikan dalam tabel no.2 dan 3. Studi fluktuasi dilakukan setelah pengubahan laju air, komposisi fasa gerak, dan pH fasa gerak. Dapat diamati bahwa perubahan kecil dalam parameter operasional, tidak menyebabkan perubahan waktu retensi puncak. Hasil Studi ketahanan ditunjukkan dalam tabel5.
Tabel 2. Sistem Presisi Amox dan Brom
| Pengulangan ke- | Amox 125µg/ml | Brom 4µg/ml |
| 1 | 255224.1 | 62953.13 |
| 2 | 248650 | 63639.35 |
| 3 | 250468.8 | 63421.6 |
| 4 | 251568.8 | 64164.7 |
| 5 | 255501 | 63648.36 |
| 6 | 249894.4 | 63021.56 |
| Rata-rata | 251884.5 | 63474.78 |
| Standar Deviasi | 2855.12 | 450.23 |
| % RSD | 1.13 | 0.70 |
| Kesalahan Standar Rata-rata | 1170.13 | 184.52 |
Tabel 3. Variabilitas Intraday dan Variabilitas Interday Amox dan Brom
| No. | Konsentrasi | ||||||
| | Amox | Brom | |||||
| | 100 | 150 | 200 | 2 | 4 | 6 | |
| 1 | Presisi Intraday | 1.06 | 0.55 | 0.80 | 1.02 | 0.94 | 0.93 |
| 2 | Presisi Interday | 1.53 | 1.39 | 1.60 | 1.90 | 1.44 | 1.002 |
Tabel 4. Studi Recovery Amox dan Brom
| Obat | Tingkat Reparasi | |||
| | 80 | 100 | 120 | |
| Amox | Rata – rata % Reparasi | 100.93 | 100.55 | 100.53 |
| % RSD (n=3) | 0.32 | 0.62 | 0.93 | |
| Brom | Rata – rata % Reparasi | 99.94 | 100.14 | 100.09 |
| % RSD (n=3) | 1.14 | 0.85 | 0.83 | |
Tabel 5. Fluktuasi Amox dan Brom
| Obat | % RSD ditemukan untuk studi kesukaran | |||||
| Laju alir (1ml/menit) | pH 5 | Rasio fasa gerak | ||||
| +0.05 | -0.05 | +0.1 | -0.1 | +1% | -1% | |
| Amox | 0.72 | 1.23 | 0.53 | 1.39 | 1.93 | 1.8 |
| Brom | 0.39 | 1.37 | 0.65 | 0.48 | 1.27 | 1.49 |
Tebel 6. Hasil Pengujian kadar
| Jumlah Zat (µg/ml) | Luas puncak | Temuan (µg/ml) | % kadar | ||||
| Amox | Brom | Amox | Brom | Amox | Brom | Amox | Brom |
| 125 | 4 | 245224.1 | 62753.13 | 122.75 | 3.92 | 98.20 | 98.15 |
| 125 | 4 | 248600 | 63639.35 | 124.65 | 3.97 | 99.72 | 99.47 |
| 125 | 4 | 251468.8 | 63421.6 | 126.26 | 3.96 | 101.01 | 99.15 |
| 125 | 4 | 253568.8 | 64564.7 | 127.44 | 4.03 | 101.95 | 100.84 |
| 125 | 4 | 245501 | 63648.36 | 122.91 | 3.97 | 98.33 | 99.48 |
Metode yang diusulkan dijabarkan dalam bentuk kadar kapsul yang mengandung AMOX dan Brom dengan Limakali pegulangan.Persen kadaryang diperoleh adalah 98,20-101,95% untuk AMOX dan 98,15-100,84% untuk Brom. Hasil analisis kapsulditunjukkan pada tabel 6.
BAB III
KESIMPULAN
KESIMPULAN
HPLC merupakan metoda pemisahan yang dapat digunakan untuk analisis Amoksisilin dan Bromheksin yang terdapat dalam obat Bromolin-250. HPLC dilakukan dalam Kolom Silica C-18, dengan fasa gerak Metanol 0.02M dengan Amonium Asetat pada pH 5 (90:10 v/v). Dari kromatogram larutan kerja standar (campuran AMOX dan Brom) teramati pada panjang gelombang 254 nm, baik AMOX mupun Brom menunjukkan serapan yang cukup besar danAMOX menunjukkan absorbansi relatif rendah dibandingkanBrom sehingga dipilih sebagai pendeteksipanjang gelombang. Berdasarkan kurva kalibrasi, diketahui bahwa metode HPLC merupakan metode pemisahan yang tepat untuk menentukan Amoksisilin dan Bromheksin dalam sampel obat Bromolin-250. Hubungan linier antara luas puncak dan konsentrasi dapat diamati selama rentang 100-300 µg/ml untuk AMOX dan 2-10 µg/ml untuk Brom. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi, yang mana untuk AMOX 0,993 dan 0,995 Untuk ketiga tingkat konsentrasi. Persen RSD diperoleh kurang dari 2% untuk kedua obat. Dari studi fluktuasi dapat diamati bahwa perubahan kecil dalam parameter operasional, tidak menyebabkan perubahan waktu retensi puncak. Persen kadar yang diperoleh adalah 98,20-101,95% untuk AMOX dan 98,15-100,84% untuk Brom.Data validasimenunjukkan presisi dan akurasi yang baik, dimana dapatmembuktikan keandalan dari metode yang diusulkan. Oleh karena itu,metode HPLC dapat digunakan secara rutin untukestimasi kuantitatif dari kedua komponen dalam bentuk dosis oral padat.
DAFTAR PUSTAKA
Madhura, 2010, High Performance Liquid Chromatograpgic Method for Determination of Amoxicillin Trihydrate and Bromhexine Hydrochloride in Oral Dosage Forms, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 2, supply 1.
http://www.google.co.id/imglanding?q=instrumen+HPLC&um=1&hl=id&client=firefox-a&sa
Komentar
Posting Komentar