METODE HPLC UNTUK PENENTUAN AMOKSISILIN TRIHIDRAT DAN BROMHEKSIN HIDROKLORIDA DALAM KAPSUL BROMOLIN-250
MAKALAH
METODE HPLC UNTUK PENENTUAN AMOKSISILIN TRIHIDRAT DAN BROMHEKSIN HIDROKLORIDA DALAM KAPSUL BROMOLIN-250
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Seminar Kimia
Penyaji:
Yaktiva Dwi Purnama
0706767
Dosen Pembimbing:
Dr. Sumar Hendayana, M.Sc
Jurusan Pendidikan Kimia
Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Pendidikan Indonesia
2010
ABSTRAK
HPLC merupakan metode pemisahan yang dapat digunakan untuk analisis Amoksisilin dan Bromheksin yang terdapat dalam obat Bromolin-250. HPLC dilakukan dalam Kolom Silica C-18, dengan fasa gerak Metanol 0.02M dengan Amonium Asetat pada pH 5 (90:10 v/v). Dari kromatogram larutan kerja standar (campuran AMOX dan BROM) diketahui bahwa λmax yaitu 254 nm. Sementara berdasarkan kurva kalibrasi, diketahui bahwa metode HPLC merupakan metode pemisahan yang tepat untuk menentukan Amoksisilin dan Bromheksin dalam sampel obat Bromolin-250. Linieritas dapat teramati pada kurva kalibrasi antara konsentrasi terhadap luas area pada rentang 100-300 mg/ml untuk AMOX dan 2-10 mg/ml untuk BROM. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi, yang mana untuk AMOX 0,993 dan 0,995 untuk ketiga tingkat konsentrasi. % RSD diperoleh kurang dari 2% untuk kedua obat. Berdasarkan data yang diperoleh, recovery memenuhi syarat pedoman ICH yaitu ±5%. Dari validasi ketahanan dapat diamati bahwa perubahan kecil dalam parameter operasional, tidak menyebabkan perubahan waktu retensi puncak. Persen kadar yang diperoleh adalah 98,20-101,95% untuk AMOX dan 98,15-100,84% untuk Brom.
Kata Kunci: Amoksisilin Trihidrat, Bromheksin Hidroklorida, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
BAB I
PENDAHULUAN
Amoksisilin dan Bromheksin biasanya digunakan secara klinis untuk pengobatan penyakit bronkitis akut maupun kronis. Survei mengungkapkan bahwa Amoksisilin Trihidrate (AMOX) biasanya ditentukan menggunakan Spectrophotometry, HPLC, HPLC dengan Fluorimetric detection, HPLC dengan array dioda foto detection danvoltametry. Sedangkan Bromheksin hidroklorida (BROM) digunakan dalam pengobatan gangguan pernapasan terkait dengan batuk produktif. senyawa inibiasanya ditentukan dengan teknik yang sedikit berbeda, sepertispectrophotometry, HPLC, kolorimetri, TLC, flow-injeksi-spectrophotometry, GC, ion-elektroda selektif (ISE), analisis linear hybrid, kapiler isotachophoresis, spektrofotometri serapan dan electrophoresis. Obat-obatan ini telah dianalisis dengan banyak metode, namun hanya metode HPLC microbore yang dilaporkan dapat menmberikan hasil pemisahan yang efisien untuk kombinasi kedua obat ini dengan menghasilkan presisi dan akurasi yang baik, pemisahan yang efisien, dan recovery yang memenuhi syarat sesuai pedoman ICH.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam sampel di berbagai bidang, antara lain farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri makanan.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa–senyawa tidak mudah menguap (non-volatil), penentuan molekul–molekul netral, ionik, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa–senyawa yang strukturnya hampir sama; pemisahan senyawa–senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode yang tidak dekstruktif (merusak) dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa–senyawa tertentu seperti asam amino, asam nukleat, dan protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk degradasi dalam sediaan farmasi; memonitor sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan senyawa dalam suatu campuran, memisahkan polimer dan menentukan distribusi berat molekulnya dalam suatu campuran, kontrol kualitas; dan mengikuti jalannya reaksi sintetis.
Fase gerak atau eluen merupakan komponen penting dalam HPLC yang biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen–komponen sampel. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah–ubah selama elusi) (Rohman, 2007).
BAB II
ISI
ISI
METODE HPLC UNTUK PENENTUAN AMOKSISILIN TRIHIDRAT DAN BROMHEKSIN HIDROKLORIDA DALAM KAPSUL BROMOLIN-250
2.1 DASAR TEORI
2.1.1 HPLC
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran. Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan diantara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Pemisahan dengan kromatografi didasarkan pada perbedaan kesetimbangan diantara komponen-komponen campuran diantara fasa gerak (fasa mobil) dan fasa diam.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang stasioner. Fasa diam bisa merupakan suatu zat padat atau suatu cairan, dan fasa yang bergerak bisa merupakan suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal terbagi menjadi empat golongan yaitu kromatografi cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Underwood, 1986).
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) adalah kromatografi dengan zat cair sebagai fasa gerak dan fasa diam. Dalam kromatografi cair (HPLC) kedudukan gas diganti oleh zat cair yang bertekanan tinggi (Hendayana, S, 1994:251).
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solut melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya, dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak, HPLC dikelompokkan atas HPLC fasa normal dan fasa terbalik. HPLC dengan kombinasi fasa diam polar dan fasa gerak non polar disebut HPLC fasa normal. HPLC fasa normal tidak dapat diterapkan pada cuplikan yang bersifat polar. Untuk memisahkan cuplikan yang bersifat polar maka kombinasi fasa gerak dan fasa diam harus dibalik, yaitu fasa diam non polar dikenal dengan istilah HPLC fasa terbalik. (Hendayana, S, 2006:83-85)
Dalam HPLC, zat cair digunakan sebagai fasa gerak. Sebagai akibat penggunaaan fasa gerak zat cair maka sangat sukar zat cair mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara cepat maka dibutuhkan bantuan pompa bertekanan tinggi.
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut: dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi dengan oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan jumlah komponen sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. (Hendayana, S, 2006:83-85)
Instrumentasi kromatografi cairan kinerja tinggi atau HPLC adalah sebagai berikut:
1. Fasa gerak
Fasa gerak dalam HPLC berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut.
Persyaratan fasa gerak HPLC yaitu:
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
b. Zat cair harus murni untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram.
c. Zat cair harus jernih untuk menghindari penyumbatan pada kolom.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
e. Zat cair tidak kental.
f. Sesuai dengan detektor.
2. Pompa (pump)
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan yaitu menghasilkan tekanan sampai 600 psi (pons/ins2), keluaran bebas pulsa, kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit, bahan tahan korosi,dan dapat mengalirkan fasa gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. Ada tiga tipe pompa yang masing-masing memiliki keuntungan dan kekurangannya yaitu:
a. Pompa Reciprocating
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu dibutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadap aliran. Keuntungannya adalah ukuran reservoir tidak terbatas.
b. Pompa Displacement
Pompa ini menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan balik kolom dan visikositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (~250mL) dan tidak mudah untuk melakukan penggantian pelarut.
c. Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekenanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada visikositas pelarut dan tekanan balik kolom.
Fasa gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga cara, yaitu:
a. Isokratik: aliran tetap (konstan) dan ketetapan komposisi dari fasa gerak tetap berlaku.
b. Elusi bergradien (Gradient elution): aliran konstan dan perubahan komposisi dari fasa gerak terjadi. Mode gradien memberikan pemisahan yang lebih sempurna daripada mode isokratik.
c. Flow program: aliran bervariasi dan ketetapan komposisi dari fasa gerak terjadi.
(Wiryawan, A., 2008:253)
3. Pemasukan cuplikan
Sampel yang dapat diamati dengan HPLC memiliki beberapa persyaratan yaitu senyawa-senyawa ionik, senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan mengalami peruraian), dan senyawa-senyawa dengan massa molekul yang besar. Cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh μL. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Beberapa teknik pemasukkan cuplikan ke dalam sistem HPLC yaitu injeksi syringe, injeksi stop flow, dan kran cupikan. Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak melalui dua langkah: 1) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop. 2) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak melalui kolom.
4. Kolom
Kolom merupakan tempat berlangsungnya pemisahan komponen campuran. Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel walaupun ada juga yang terbuat dari geals berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Bergantung keperluannya, kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparasi.
a. Kolom analitik
Diameter dalam 2-6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Umtuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50-100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10-30 cm. Dewasa ini ada yang berukuran 5 cm.
b. Kolom preparatif
Umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dengan panjang kolom 25-100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainless dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT yang digunakan (LSC, LLC, IEC atau EC). Untuk keperluan preparatif, setiap komponen yang keluar dari kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colectur. Kolom utama berisi fasa diam berupa cairan sukar menguap dan stabil, misalnya C-18.
Selain kolom utama, dikenal pula kolom pengaman (guard kolom). Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu untuk menyaring kotoran yang terbawa dalam fasa diam dan untuk menjenuhkan fasa diam dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran pelarut. Dengan demikian, kerusakan kolom utama yang mahal dapat dihindarkan.
5. Detektor
Alat ini mendeteksi komponen-komponen yang meninggalkan kolom. Detektor HPLC dikelompokkan ke dalam tiga jenis yaitu detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi dengan adanya solut, detektor spesifik memberi respon terhadap beberapa sifa solut yang tidak dimiliki oleh fasa gerak. Terakhir, detektor yang bersifat umum terhadap solut, setelah fasa gerak dihilangkan dengan penguapan. Ada beberapa contoh detektor HPLC, diantaranya detektor UV, detektor elektrokimia, dan detektor fluorometrik.
Adapun persyaratan detektor HPLC :
a. Sensitif
b. Stabilitas dan keterulangan tinggi
c. Respon linear terhadap solut
d. Waktu respon pendek sehingga tidak tergantung kecepatan alir
Tabel 2.1.1 Jenis-Jenis Detektor
Detektor | Sensitifitas (g/mL) | Kisaran Linier | Karakteristik |
Absorbansi Uv-Vis Fotometer Filter | 5x10-10 | 104 | Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh |
Spektrofotometer | 5x10-10 | 105 | |
Spectrofotometer Photodiode array | <2x10-10 | 105 | |
Fluoresensi | 10-12 | 102 | Sensitivitas sangat bagus, selektif, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak |
Indeks Bias | 5x10-3 | 102 | Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang, sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien |
Elektrokimia Konduktometri | 10-8 | 104 | Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien, hanya mendeteksi solut-solut ionik, sensitivitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda |
Amperometri | 10-12 | 105 |
6. Recorder (komputer dan Printer)
Hasil percobaan akan dicetak dalam bentuk kromatogram yang terlihat oleh komputer. Kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (tr) analit/sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan didasarkan pada luas area peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.
Pembahasan teknik kromatografi modern baru lengkap bila disebut kromatografi cairan penampilan tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fasa cair mengalir perlahan melewati kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber,yang bekerja pada tekanan sampai 2,07x107Nm-2 (3000 psi). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 m dan eluen dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1). Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik. Pengembangan penerapan dalam anorganik menjadi mungkin, misalnya dalam bidang kromatografi pertukaran ion di mana telah tersedia dipasar dengan nama dagang ‘Zipax’ resin peliklar, yakni resin yang dihasilkan dalam bentuk saluran tipis pada permukaan manik kaca yang blat (diameter 2050 mikrometer). Manik-manik itu mempunyai permukaan berpori yang tebalnya 2 mikrometer yang berperan sebagai pengikat saluran resin itu (Bassett et. all., 1994).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fasa gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 m; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003).
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil. Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer satu sama lainnya, keduanya efisien, sangat selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Khopkar, 2003).
Selain itu, kelebihan HPLC antara lain:
a. Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
b. Mudah melaksanakannya
c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang dianalisis
e. Resolusi yang baik
f. Dapat digunakan macam-macam detektor
g. Kolom dapat digunakan kembali
2.1.2 Amoksisilin Trihidrat
Amoksisilina Trihidrat memiliki rumus molekul C16H19N3O5S.3H2O, berat molekul 419,45 dan 365,9 dalam bentuk anhidrat. Amoksisilina Trihidrat berupa serbuk hablur, putih, tidak berbau, sukar larut dalam air dan metanol, tidak larut dalam benzen, karbon tetraklorida dan dalam kloroform.
Amoxicillin mempunyai nama generik Amoxicillin dengan nama paten yang jumlahnya mencapai ratusan buah. Penmox, Intermoxyl, Ospamox, Amoxsan, Hufanoxyl, Yusimox merupakan beberapa nama dagang atau nama paten dari antibiotika ini.
Amoxicillin adalah antibiotika yang termasuk ke dalam golongan penisilin. Obat lain yang termasuk ke dalam golongan ini antara lain Ampicillin, Piperacillin, Ticarcillin, dan lain lain. Karena berada dalam satu golongan maka semua obat tersebut mempunyai mekanisme kerja yang mirip. Obat ini tidak membunuh bakteri secara langsung tetapi dengan cara mencegah bakteri membentuk semacam lapisan yang melekat disekujur tubuhnya. Lapisan ini bagi bakteri berfungsi sangat vital yaitu untuk melindungi bakteri dari perubahan lingkungan dan menjaga agar tubuh bakteri tidak tercerai berai. Bakteri tidak akan mampu bertahan hidup tanpa adanya lapisan ini.
Amoksisilin mempunyai spektrum antibiotik serupa dengan ampisilin. Beberapa keuntungan amoksisilin dibanding ampisilin adalah absorbsi obat dalam saluran cerna lebih sempurna, sehingga kadar darah dalam plasma dan saluran seni lebih tinggi. Efek terhadap Bacillus dysentery amoksisilin lebih rendah dibanding ampisilin karena lebih banyak obat yang diabsorbsi oleh saluran cerna (Siswandono, 2000).
Amoksisilin merupakan turunan dari penisilin yang stabil dalam suasana asam lambung. Amoksisilin diabsorpsi dengan cepat dan baik pada saluran pencernaan, tidak tergantung adanya makanan. Amoksisilin terutama diekskresikan dalam bentuk tidak berubah di dalam urin. Ekskresi Amoksisilin dihambat saat pemberian bersamaan dengan probenesid sehingga memperpanjang efek terapi (Siswandono, 2000).
Namun, resistensi terhadap amoksisilin dan ampisilin merupakan suatu masalah, karena adanya inaktifasi oleh plasmid yang diperantai penisilinase. Pembentukan dengan penghambat β–laktamase seperti asam klavunat atau sulbaktam melindungi amoksisilin atau ampisilin dari hidrolisis enzimatik dan meningkatkan spektrum antimikrobanya (Mycek, 2001).
Amoksisilin adalah antibiotik dengan spektrum luas, digunakan untuk pengobatan seperti untuk infeksi pada saluran napas, saluran empedu, dan saluran seni, gonorhu, gastroenteris, meningitis dan infeksi karena Salmonella sp., seperti demam tipoid. Amoxicillin adalah turunan penisilin yang tahan asam tetapi tidak tahan terhadap penisilinase (Siswandono, 2000).
Amoksisilin digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri Gram-negatif seperti Haemophilus Influenza, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella. Amoksisilin juga dapat digunakan untuk mengatasi infeksi yang disebabkan oleh bakteri Gram-positif seperti: Streptococcus pneumoniae, enterococci, nonpenicilinase-producing staphylococci, Listeria. Amoksisilin diindikasikan untuk infeksi saluran pernapasan, infeksi saluran kemih, infeksi klamidia, sinusitis, bronkitis, pneumonia, abses gigi dan infeksi rongga mulut lainnya (Siswandono, 2000).
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Disisi lain, bakteri Gram-positif akan berwarna ungu. Perbedaan keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri. Bakteri Gram-positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90% dari dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
Amoksisilin aktif melawan bakteri Gram positif yang tidak menghasilkan β-laktamase dan aktif melawan bakteri gram negatif karena obat tersebut dapat menembus pori–pori dalam membran fosfolipid luar. Untuk pemberian oral, amoksisilin merupakan obat pilihan karena di absorbsi lebih baik daripada ampisilin, yang seharusnya diberikan secara parenteral (Neal, 2007).
Tabel 2.1.2 Karakteristik dari Bakteri Gram positif dan Negatif
Karakteristik | Gram Positif | Gram Negatif |
Dinding Sel | Homogen dan tebal (20-80 nm0 serta sebagian besar tersusun dari peptidoglikan. Polisakarida lain dan asam teikoat dapat ikut menyusun dinding sel. | Peptidoglikan (2-7nm) di antara membran dan luar, serta adanya membran luar (7-8 nm tebalnya) yang terdii dari lipid, protein, dan lipopolisakarida |
Bentuk Sel | Bulat, batang atau filamen | Bulat, oval, batang lurus atau melingkar seprti tanda koma, heliks atau filamen; beberapa mempunyai selubung atau kapsul |
Reproduksi | Pembelahan biner | Pembelahan biner, kadang-kadang pertunasan |
Metabolisme | kemoorganoheterotrof | Fototrof, kemolitoautotrof, atau kemoorganoheterotrof |
Motilitas | Kebanyakan nonmotil, bila motil tipe flagelanya adalah petritrikus (petritrichous) | Motil atau nonmotil. Bentuk flagela dapat bervariasi-polar,lopotrikus (lophtrichous), petritrikus (petritrichous). |
Anggota Tubuh (Apendase) | Biasanya tidak memiliki apendase | Dapat memiliki pili, fimbriae, tangkai |
Endospora | Beberapa grup dapat membentuk endspora | Tidak dapat membentuk endospora |
Sesuai dengan mekanisme kerja diatas maka Amoksisilin seharusnya memang digunakan untuk mengobati penyakit penyakit yang disebabkan oleh kuman kuman yang sensitif terhadap Amoksisilin. Beberapa penyakit yang biasa diobati dengan Amoksisilin antara lain infeksi pada telinga tengah, radang tonsil, radang tenggorokan, radang pada laring, bronchitis, pneumonia, infeksi saluran kemih, dan infeksi pada kulit.
Obat ini tersedia di pasaran dalam bentuk Kapsul : 250 dan 500 mg. Tablet : 500 mg. Sirop kering : 125mg/5ml dan 250mg/5ml. Vial untuk injeksi : 1000mg dan 500mg.
Dosis therapi untuk Amoxicillin pada orang dewasa adalah 250 mg setiap 8 jam, 500 mg setiap 8 jam, 500 mg setiap 12 jam, terggantung dari derajat keparahan dari penyakit yang di derita. Untuk pengobatan gonorrhea pada orang dewasa, diberikan Amoxicillin sebanyak 3 g sekali minum. Dosis untuk anak anak diatas 3 bulan adalah 25 mg/kg/hari terbagi setiap 12 jam, 20 mg/kg/hari terbagi setiap 8 jam, 40 mg/kg/hari terbagi setiap 8 jam atau 45 mg/kg/hari terbagi dalam 12 jam terggantung dari derajat keparahan penyakit.
Dosis amoksisilina juga disesuaikan dengan berat badan pasien, yaitu:
ü Anak dengan berat badan kurang dari 20 kg: 20 – 40 mg/kg berat badan sehari, terbagi dalam 3 dosis.
ü Dewasa atau anak dengan berat badan lebih dari 20 kg: 250 – 500 mg sehari, sebelum makan.
2.1.3 Bromheksin HCL
Sedikitnya dikenal tiga golongan obat untuk mengatasi batuk. Pertama ialah antitusif yang menekan refleks batuk, Kodein merupakan contohnya. Golongan kedua disebut ekspektoran. Ini merangsang sekresi sputum dari saluran nafas, disamping kadang-kadang bersifat merangsang muntah (emetik). Yodium dan amonium khlorida dalam Obat Batuk Hitam (OBH) merupakan contohnya. Belakangan ini sering digunakan gliseril guaiakolat sebagai ekspektoran. Tapi meskipun penderita telah dirangsang dengan ekspektoran, sputum kadang-kadang masih sulit dikeluarkan dari saluran nafas. Maka dicarilah obat lain, golongan mukolitik. Obat golongan ini menghancurkan atau mengencerkan sputum sehingga mudah dikeluarkan. Beberapa zat mukolitik diantaranya air, chymotrypsin dan enzim-enzim lain, asetilsistein dan metilsistein dan bromheksin. Tingginya kekentalan sputum pada penderita asma atau bronkhitis kronis misalnya, disebabkan oleh dua jenis jaringan benang dalam sputum, yaitu benang-benang DNA (deoxyribonucleic acid), dan benang muko polisakrida. Benang DNA hanya ada dalam sputum yang purulen, karena ini berasal dari inti sel-sel mukosa yang hancur. Sedangkan benang-benang muko polisakarida banyak ditemukan pada sputum yang mukoid. Benang jenis kedua ini sedikit ditemukan dalam sputum yang purulen karena telah dihancurkan oleh enzim-enzim bakteri. Dengan terapi antibiotika yang efektif, kerusakan mukosa dapat dicegah, sehingga benang-benang DNA akan makin sedikit. Tapi ternyata saat itu sputum masih kental karena benang-benang mukopolisakarida muncul kembali. Bromheksin bekerja dengan cara menghancurkan benang-benang mukopolisakarida itu menjadi fragmen-fragmen kecil, sehingga sputum menjadi encer. Selain itu, dengan penyelidikan mikroskop elektron diketahui bahwa bromheksin juga menyebabkan perubahan pada granula pada kelenjar-kelenjar penghasil mukus di mukosa bronkhial dan hidung.
Bromheksin adalah agen mucolytic yang digunakan dalam pengobatan gangguan pernapasan terkait dengan lendir kental atau berlebihan. Selain itu, bromheksin memiliki sifat antioksidan. Fungsi bromheksin mendukung mekanisme sendiri alami tubuh untuk membersihkan lendir dari saluran pernapasan. Zat ini adalah turunan sintetik dari vasicine, suatu alkaloid yang berasal dari tumbuhan Adhatoda vasica yang berasal dari India. Bromheksin diakui sebagai obat yang punya khasiat spesifik terhadap sputum dan bermanfaat dalam klinik. Kini obat ini banyak dipakai untuk berbagai penyakit saluran pernafasan.
Keuntungan lain dari penggunaan bromheksin ialah dapat meningkatkan kadar tetrasikin atau oksitetrasiklin dalam sekret bronkhial. Maka kombinasi antibiotika ini dengan bromheksin dilaporkan lebih efektif daripada tetrasiklin saja. Pada penderita yang gawat bromheksin dapat diberikan secara parenteral. Bila ada infeksi bakterial, antibiotika harus diberikan juga disamping bromheksin. Pemberian Bromheksin HCl bersamaan dengan antibiotika (Amoksisilin, Sefuroksim, Doksisiklin) akan meningkatkan konsentrasi antibiotika dalam jaringan paru.
Bromheksin HCL memiliki nama 2-Amino-3.5-dibromobenzyl (cyclohexyl) methylamine hydrochloride dengan struktur C14H20Br2N2.HCl. Bromheksin HCL berbentuk serbuk kristal warna putih atau hampir putih, tidak larut dalam air, sedikit larut dalam alkohol dan kloroform.
Bromheksin bersifat sekretolitik (pengencer dahak), yaitu meningkatkan produksi lendir serosa dalam saluran pernafasan dan membuat dahak lebih tipis dan kurang lengket. Hal ini memberikan kontribusi untuk efek secretomotoric. Ini dapat membantu siliarambut kecil yang melapisi saluran pernapasan untuk transportasi dahak keluar dari paru-paru. Untuk alasan ini sering ditambahkan ke beberapa sirup antitusif.
Dosis Bromheksin
· Dosis oral untuk orang dewasa ialah 3 kali sehari 8 -16 mg.
· Dosis oral untuk anak-anak dibawah 5 tahun, 2 kali sehari 4 mg.
· Dosis oral untuk anak-anak 5 -10 tahun, 4 kali sehari 4 mg
2.1.4 Bromolin-250
Bromolin-250 merupakan obat yang digunakan dalam pengobatan infeksi saluran pernapasan atas dan bawah seperti bronkitis akut dan kronis, sinusitis, pneumonia, abses paru, bronkiektasis dan penyakit seperti asma dan penyakit saluran napas obstruktif.Tiap kapsul bromolin-250 mengandung amoksisilin 250 mg dan 8 mg bromheksin hidroklorida.
2.1.5 Validasi Metode
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.
ü Linieritas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Sedangkan rentang adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit.
Dalam beberapa kasus, untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya.
Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50–150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Jumlah sampel yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko.
Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau –1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy).
ü Presisi (keseksamaan)
Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi). Presisi dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau reproducibility (ketertiruan).
Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda.
analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan peralatan, pereaksi, dan analis yang berbeda.
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis.
Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%.
Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit enam replika sampel yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya keseksamaan ditentukan terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa terhadap keseksamaan ini. Demikian juga harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap keseksamaan ini.
ü Keakuratan (Accuracy)
Keakuratan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Keakuratan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Keakuratan dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).
Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo (semua campuran reagent yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi.
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa (analit atau standar murni) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil yang diharapkan).
Pada metode penambahan baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Dalam kedua metode tersebut, recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah ±5%.
ü Kekuatan (Robustness)
Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak (± 0,2 unit), dan perubahan temperatur kolom (± 2 - 3° C).
Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau diubah. Faktor orisinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan.
ü Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of Quatification)
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Sedangkan Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen, batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan.
Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y=a+bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual.
2.2 PROSEDUR EKSPERIMEN
1. ALAT DAN BAHAN
Alat
a. Pompa PU2080 plus
b. Injeksi sampel 20 µl
c. Detektor UV 2075 plus
d. Komputer (Software Borwin versi 1,5)
e. Kolom C-18 (4,6 x 250 mm, 5µ)
f. pH delux 101
Bahan
a. Bromolin -250
b. Amonium Asetat 0,02M
c. Orto-asam fosfat
d. Metanol
e. Sil C18 (Octadecyl bonded silica)
2. LANGKAH KERJA
· Pembuatan Larutan stok standar
Masing-masing 10 mg Amox dan Brom diletakkan dalam 10 ml labu volumetrik terpisah dan dilarutkan dalam fasa gerak untuk mendapatkan konsentrasi akhir 1mg/ml.
· Pembuatan fasa gerak
Metanol dilarutkan dalam amonium asetat 0,02M yang dijaga pHnya tetap 5 dengan bantuan asam ortofosfat (aq) 10% (dengan perbandingan 90:10). Larutan disaring menggunakan membran filter 0,45 pM dan disonikasi pada ultrasonic bath.
· Pembuatan larutan standar untuk kurva kalibrasi
Larutan stok AMOX diencerkan dengan berbagai jenis konsentrasi diantaranya konsentrasi 100, 150, 200, 250, 300 µg/ml. Larutan stok Brom diambil 1ml untuk diencerkan dengan 10 ml fase gerak. Larutan ini diencerkan lebih lanjut untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml.
· Pembuatan larutan sampel atau analisis kapsul
Sampel yang digunakan adalah Bromolin-250. Tiap kapsul mengandung amoksisilin 250 mg dan bromhexine Hidroklorida 8 mg. Dua puluh Kapsul, masing-masing berisi AMOX 250 mg dan 8 mg Brom diambil isinya dan dihaluskan. 25 mg AMOX ditimbang dan dipindahkan ke 25 ml labu volumetrik. 20 ml fase gerak ditambahkan ke labu yang sama dan disonikasi selama 10 menit. Ditambahkan fasa gerak hingga volume mencapai 25ml. Larutan disaring menggunakan kertas filter whatman no. 41 dan kemudian disaring lagi dengan kertas saring 0,45μ untuk menghilangkan kotoran. Filtrat yang diperoleh kemudian diencerkan menggunakan fasa gerak untuk mendapatkan larutan125 µg/ml AMOX dan 4 µl/ml Brom. Lakukan hal yang sama hingga lima kali, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem.
· Pengenceran untuk penentuan keseksamaan (precision)
Dalam validasi keseksamaan (precision), campuran standar (berisi AMOX 125μg/ml dan Brom 4μg/ml) digunakan dengan 6 kali pengulangan. Sedangkan studi keterulangan dilakukan dengan 3 kali pengulangan pada 3 tingkat konsentrasi. Untuk Intravariabilitas, percobaan dilakukan dalam satu hari, sedangkan untuk Intervariabilitas dilakukan dalam 3 hari berturut-turut. Macam-macam konsentrasi yang digunakan untuk AMOX adalah 100µg/ml, 150µg/ml, 200 µg/ml dan untuk Brom adalah 2µg/ml, 4µg/ml, 6 µg/ml.
· Pengenceran untuk penentuan keakuratan (accuracy/recovery)
Untuk mengkaji keakuratan metode, studi penemuan kembali (recovery) dilakukan dengan penambahan larutan standar adisi pada sampel dengan 3 macam konsentrasi yang berbeda, 80%, 100% dan 120% dari konsentrasi-konsentrasi yang diuji (konsentrasi uji 125μg/ml untuk AMOX dan 4 μg/ml untuk Brom)
· Penetuan Ketahanan/kekuatan (robustness)
Ketahanan dari suatu metode dapat ditentukan dengan sederhana, seperti dengan mempertimbangkan perubahan laju alir, rasio fase gerak, panjang gelombang deteksi dan pH fase gerak. Laju alirdiubah menjadi 1±0,05 ml/menit. Rasio fasa gerak diubah menjadi ±1% untuk metanol, pH fase gerak diubah menjadi 5±0,1
· Pengujian kecocokan sistem
Pengujian kecocokan sistem digunakan untuk memverifikasi bahwa resolusi dan reproduktifitas dari sistem memadai untuk analisis yang akan dilakukan. Parameter seperti pelat teoritis, faktor bagian akhir, resolusi ditentukan dan dibandingkan terhadap spesifikasi.
3. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Tabel 2.2.1 Ringkasan kondisi kromatografi
No. | Parameter | Kondisi |
1 | Kolom | HiQ Silica C-18 (4.6 x 250mm, 5µm) |
2 | Fasa Gerak | Metanol : 0,02M Amonium Asetat pH 5 (90:10) |
3 | Laju Alir | 1mL/menit |
4 | Panjang Gelombang Deteksi | 254 nm |
5 | Injeksi Sampel | 20µL putaran |
2.2.1 Validasi Metode
Larutan standar Amoksisilin Trihidrat (AMOX) dan Bromheksin Hidroklorida (BROM) diinjeksikan ke dalam sistem HPLC dan dialirkan dalam sistem pelarut (fasa gerak) yang berbeda. Fasa gerak yang digunakan mengandung metanol, buffer (fosfat, amonium asetat) diujikan dengan perbandingan akhir methanol:ammonium asetat 0,02M yang pH nya disesuaikan menjadi pH-5 dengan bantuan orto-asam fosfat (90:10). Perbandingan ini dipilih sebagai perbandingan fasa gerak yang tepat dimana dapat memberikan resolusi yang baik dan parameter puncak dapat diterima untuk keduanya (AMOX dan Brom). Berikut kromatogram yang diperoleh ketika dilakukan pemisahan Amoksisilin dan Bromheksin dalam obat Bromolin-250. Amoksisilin lebih dulu terelusi karena memiliki kepolaran yang relatif mirip dengan fasa gerak dibandingkan bromheksin.
Selanjutnya, dari larutan stok (AMOX 125 μg/ml dan Brom 4 µg/ml) yang diencerkan menggunakan fase gerak dapat teramati bahwa pada rentang 200-400 nm spektrumnya tumpang tindih. Baik AMOX mupun Brom menunjukkan serapan yang cukup besar. Pada faktanya, isi AMOX jauh lebih besar (125mg) dari BROM (4mg), namun disini terlihat bahwa AMOX menunjukkan absorbansi relatif rendah dibandingkan BROM. Hal itu teramati pada panjang gelombang 254 nm, sehingga dipilih sebagai pendeteksi panjang gelombang.
ü Linieritas dan Rentang
Selanjutnya, Linieritas yang diperoleh dari kurva antara konsentrasi terhadap luas area dapat diamati pada rentang panjang gelombang 100-300 µg/ml untuk AMOX dan 2-10 µg/ml untuk Brom. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi, yang mana untuk AMOX 0,993 dan 0,995 untuk BROM.
ü Keseksamaan (presisi)
Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai sistem presisi dan keterulangan pada pedoman ICH. Pada validasi presisi, dapat ditentukan dengan menggunakan campuran larutan standar dan dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan. Sedangkan pada validasi keterulangan, digunakan 3 macam tingkatan konsentrasi dengan 3 kali pengulangan pada setiap tingkatnya. Dari data tersebut diperoleh % RSD kurang dari 2% untuk kedua obat. Hal ini berarti metode HPLC cukup baik digunakan dalam pemisahan AMOX dan BROM pada kapsul Bromoin-250 karena memiliki %RSD < 2% sesuai pedoman ICH. Hasil validasi metode dengan parameter presisi diberikan dalam tabel no.2.2.2 (keseksamaan) dan 2.2.3 (keterulangan).
Tabel 2.2.2 Sistem Keseksamaan (presisi) Amox dan Brom
Pengulangan ke- | Amox 125µg/ml | Brom 4µg/ml |
1 | 255224.1 | 62953.13 |
2 | 248650 | 63639.35 |
3 | 250468.8 | 63421.6 |
4 | 251568.8 | 64164.7 |
5 | 255501 | 63648.36 |
6 | 249894.4 | 63021.56 |
Rata-rata | 251884.5 | 63474.78 |
Standar Deviasi | 2855.12 | 450.23 |
% RSD | 1.13 | 0.70 |
Kesalahan standar dari rata-rata (standard error of mean) | 1170.13 | 184.52 |
Tabel 2.2.3 Variabilitas Intraday dan Variabilitas Interday Amox dan Brom
No. | Konsentrasi | ||||||
Amox (µg/ml) | Brom (µg/ml) | ||||||
100 | 150 | 200 | 2 | 4 | 6 | ||
1 | Presisi Intraday | 1.06 | 0.55 | 0.80 | 1.02 | 0.94 | 0.93 |
2 | Presisi Interday | 1.53 | 1.39 | 1.60 | 1.90 | 1.44 | 1.002 |
ü Keakuratan (Accuracy)
Keakuratan metode dapat dilakukan dengan recovery atau temuan kembali analit yang sebenarnya. Berdasarkan percobaan, diperoleh recovery 99.94%-100.93%. hal ini sesuai dengan syarat recovery yang baik, yaitu penemuan kembali tidak boleh lebih atau kurang dari 5% dari yang seharusnya (95%-105%). jika nilainya <100%, artinya tidak semua analit ditemukan kembali setalah dilakukan pengujian. Namun, jika nilainya >100% artinya semua analit ditemukan kembali dan terdapat matriks-matriks yang menyebabkan nilainya >100%..
Tabel 2.2.4 Temuan Kembali (recovery) Amox dan Brom
Obat | Konsentrasi standar adisi (%) | |||
80 | 100 | 120 | ||
Amox | Rata – rata % recovery | 100.93 | 100.55 | 100.53 |
% RSD (n=3) | 0.32 | 0.62 | 0.93 | |
Brom | Rata – rata % recovery | 99.94 | 100.14 | 100.09 |
% RSD (n=3) | 1.14 | 0.85 | 0.83 | |
ü Ketahanan (Robustness)
Penentuan ketahanan metode dilakukan setelah pengubahan laju air, komposisi fasa gerak, dan pH fasa gerak. Dapat diamati bahwa perubahan kecil dalam parameter operasional, tidak menyebabkan perubahan waktu retensi puncak yang signifikan. Hasil ketahanan metode ditunjukkan dalam tabel 2.2.5.
Tabel 2.2.5 Penentuan Ketahanan (robustness) metode untuk Amox dan Brom
Obat | % RSD yang ditemukan pada studi kesukaran | |||||
Laju alir (1ml/menit) | pH 5 | Rasio fasa gerak (metanol) | ||||
+0.05 | -0.05 | +0.1 | -0.1 | +1% | -1% | |
Amox | 0.72 | 1.23 | 0.53 | 1.39 | 1.93 | 1.8 |
Brom | 0.39 | 1.37 | 0.65 | 0.48 | 1.27 | 1.49 |
Selanjutnya, metode yang diusulkan dijabarkan dalam bentuk kadar kapsul yang mengandung AMOX dan BROM yang dilakukan dengan lima kali pegulangan. Persen kadar yang diperoleh adalah 98,20-101,95% untuk AMOX dan 98,15-100,84% untuk BROM. Hasil analisis kapsul ditunjukkan pada tabel 2.2.6.
Tebel 2.2.6. Hasil Pengujian Kadar Kapsul
Jumlah Zat yang Tercantum pada Label (µg/ml) | Luas puncak | Temuan (µg/ml) | % kadar | ||||
Amox | Brom | Amox | Brom | Amox | Brom | Amox | Brom |
125 | 4 | 245224.1 | 62753.13 | 122.75 | 3.92 | 98.20 | 98.15 |
125 | 4 | 248600 | 63639.35 | 124.65 | 3.97 | 99.72 | 99.47 |
125 | 4 | 251468.8 | 63421.6 | 126.26 | 3.96 | 101.01 | 99.15 |
125 | 4 | 253568.8 | 64564.7 | 127.44 | 4.03 | 101.95 | 100.84 |
125 | 4 | 245501 | 63648.36 | 122.91 | 3.97 | 98.33 | 99.48 |
BAB III
KESIMPULAN
KESIMPULAN
HPLC merupakan metoda pemisahan yang dapat digunakan untuk analisis Amoksisilin dan Bromheksin yang terdapat dalam obat Bromolin-250. HPLC dilakukan dalam Kolom Silica C-18, dengan fasa gerak Metanol : 0.02M dengan Amonium Asetat pada pH 5 (90:10 v/v). Dari kromatogram larutan kerja standar (campuran AMOX dan BROM) teramati pada panjang gelombang 254 nm, baik AMOX mupun Brom menunjukkan serapan yang cukup besar dan AMOX menunjukkan absorbansi relatif rendah dibandingkan BROM sehingga dipilih sebagai pendeteksi panjang gelombang. Berdasarkan kurva kalibrasi, diketahui bahwa metode HPLC merupakan metode pemisahan yang tepat untuk menentukan Amoksisilin dan Bromheksin dalam sampel obat Bromolin-250. Hubungan linier antara luas puncak dan konsentrasi dapat diamati selama rentang 100-300 µg/ml untuk AMOX dan 2-10 µg/ml untuk BROM. Linearitas dinyatakan sebagai koefisien korelasi, yang mana untuk AMOX 0,993 dan 0,995 untuk ketiga tingkat konsentrasi. % RSD diperoleh kurang dari 2% untuk kedua obat. Dari studi kekuatan (robustness) dapat diamati bahwa perubahan kecil dalam parameter operasional, tidak menyebabkan perubahan waktu retensi puncak. Persen kadar yang diperoleh adalah 98,20-101,95% untuk AMOX dan 98,15-100,84% untuk BROM. Data validasi menunjukkan presisi dan akurasi yang baik, pemisaha yang efisien, dan recovery yang memuhi syarat pedoman ICH, sehingga dapat membuktikan keandalan dari metode yang diusulkan. Oleh karena itu, metode HPLC dapat digunakan secara rutin untuk estimasi kuantitatif dari kedua komponen dalam suatu sampel obat.
DAFTAR PUSTAKA
Blogspot. 2009. Amoxicillin dan Ciprofloxacin. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.foedsblog.blogspot.com/2009/10/amoxicillin-dan-ciprofloxacin.html [diunduh 14 oktober 2010]
Health Central. 2010. Amoxil Drug Description. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.healthcentral.com/druglibrary/Amoxil.html [diunduh 15 oktober 2010]
Madhura, 2010, High Performance Liquid Chromatograpgic Method for Determination of Amoxicillin Trihydrate and Bromhexine Hydrochloride in Oral Dosage Forms, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 2, supply 1.
Mahalo. 2010. Bromhexine. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.mahalo.com/bromhexine [diunduh 15 oktober 2010]
Perpustakaan Universitas Sumatera Utara. 2009. Obat. [homepage di internet]. Tersedia dari:http://www.repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/18820/4/Chapter%20II.pdf [diunduh 5 November 2010]
Prescribing Information. 2009. Amoxil. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.us.gsk.com/products/assets/us_amoxil.pdf [diunduh 5 November 2010]
Perscription Drugs Information for Custumers. 2009. Amoxicillin Trihydrate. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.drug3k.com/drug/amoxicillin-Trihydrate-12600.htm [ diunduh 12 oktober 2010]
The Free Dictionary. 2009. Amoxil. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.medicaldictionary.thefreedictionary.com/amoxicillin+trihydrate [diunduh 2 november 2010]
Wikipedia Free Encyclopedia. 2009. Bromhexine. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.en.wikipedia.org/wiki/Bromhexine [diunduh 14 oktober 2010]
Wordpress. 2010. Analisis vitamin C dengan Metode HPLC. [homepage di internet]. Tersedia dari: http://www.yissaprayogo.wordpress.com/2010/05/21/analisis-vitamin-c-dengan-metode-hplc/ [diunduh 5 November 2010]
LAMPIRAN
Pertanyaan Mahasiswa
1. Anne Rusnita Anwar
Soal:
· Mengapa digunakan fasa gerak metanol? Bagaimana hubungannya dengan proses elusi AMOX dan BROM?
Jawab:
· Pada penentuan AMOX dan BROM menggunakan HPLC ini menggunakan HPLC fasa terbalik dimana fasa gerak lebih polar daripada fasa diam. Fasa diam yang digunakan adalah C-18, sedangkan untuk fasa gerak digunakan metanol karena sifatnya yang polar sehingga komponen yang lebih polar akan terelusi lebih dahulu, dalam hal ini AMOX. Sedangkan senyawa yang lebih non polar (BROM) dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon (C-18) karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam fasa gerak karena membutuhkan pemutusan ikatan hidrogen sebagaimana halnya senyawa tersebut berada dalam molekul metanol misalnya. Oleh karenanya, molekul non polar akan tertahan lebih lama di kolom.
Soal:
· Mengapa pada fasa gerak ditambah asam ortofosfat? Apa fungsinya?
Jawaban:
· Asam ortofosfat merupakan buffer yang digunakan agar pH fasa gerak tetap 5 karena pH optimum pemisahan AMOX dan BROM adalah pada pH 5.
Soal:
· Apakah metode UV-VIS dapat digunakan untuk analisis AMOX dan BROM? Bagaimana preparasi sampelnya?
Jawaban:
· Bisa saja, namun melihat kromatogram AMOX dan BROM yang memiliki panjang gelombang berdekatan dan hampir berhimpit membuat UV-VIS kurang efektif digunakan sehingga harus dilakukan pemisahan terlebih dahulu.
2. Nia. N
Soal:
· Berapakah rasio BROM : AMOX yang paling baik terkandung dalam Bromolin-250? Mengapa?
Jawaban:
· Tiap kapsul Bromolin-250 mengandung AMOX 250 mg dan BROM 8 mg. Jadi, tidak ada perbandingan rasio yang paling baik, karena setiap kapsul Bromolin-250 pasti mengandung AMOX 250 mg dan BROM 8 mg.
Soal:
· Bagaimana kaitan struktur BROM dan AMOX dengan pelarut yang digunakan dalam analisis?
Jawaban:
·
Dari kedua struktur tersebut, diketahui bahwa AMOX lebih polar daripada BROM. AMOX memiliki gugus karboksilat, gugus amina dan gugus hidroksi yang membuat senyawa ini sangat polar, sedangkan BROM hanya memiliki gugus amina yang membuat senyawa ini lebih nonpolar dari AMOX. Jika dilihat dari segi fasa gerak yang bersifat polar, maka memungkinkan AMOX berinteraksi dengan fasa gerak dan terelusi lebih dulu dari BROM.
Soal:
· Nilai recovery disertai % RSD atau tidak? Mengapa?
Jawaban:
· Sebenarnya nilai recovery merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Recovery dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya persyaratan untuk recovery adalah ±5%. Namun, jika disertai % RSD akan lebih meyakinkan karena dari sini diketahui bahwa metode tersebut seksama atau tidak.
3. Deni M. Ikbal, Reni Tresnawati, Azzah A, R. Amalia Juhroh, Yayang Nurhayati, Rizka Fitriani, Dewi Ernawati, Nurmalinda, Asep Rudini.
Soal:
· Atas dasar apa analisis penentuan AMOX dan BROM menggunakan HPLC?
Jawaban:
· AMOX dan BROM merupakan senyawa organik yang memiliki berat molekul yang besar, selain itu kedua senyawa ini juga memiliki gugus kromofor sehingga cocok dianalisis menggunakan HPLC.
Soal:
· Adakah penelitian sebelumnya yang meneliti zat yang sama? Seperti apa dibandingkan dengan HPLC?
Jawaban:
· Metode lain yang juga meneliti senyawa yang sama yaitu metode HPTLC. Pada metode HPTLC diperoleeh % recovery AMOX 98,59-101,58% dan BROM 99,14-101,45%. % RSD < 1,5%. Sedangkan melalui metode HPLC diperoleh % recovery untuk AMOX 100,53%-100,93% dan untuk BROM 99,94%-100,14% dengan % RSD < 1,13%. Dari data yang diperoleh untuk penentuan AMOX dan BROM diketahui bahwa metode HPLC lebih baik daripada metode HPTLC.
4. Geyra Andet Priatama
Soal:
· Mengapa metanol digunakan sebagai pelarut? Bagaimana jika diganti dengan air?
Jawaban:
· Pada HPLC fasa terbalik biasanya digunakan fasa gerak metanol atau air. Namun pada penentuan AMOX dan BROM dalam kapsul Bromolin-250 lebih dipilih metanol dengan amonium asetat karena kombinasi fasa gerak ini merupakan kombinasi yang paling cocok. Jika menggunakan air, maka fasa gerak akan menjadi sangat polar sehingga dikhawatirkan komponen AMOX terelusi sangat cepat, sedangkan BROM terelusi sangat lambat sehingga tidak efektif dalam hal waktu percobaan.
Soal:
· Bagaimana pengaruh pH pada penentuan validasi “ketahanan”?
Jawaban:
· Pada validasi ketahanan (robustness) diperoleh data bahwa perubahan kecil dalam parameter (pH) tidak menyebabkan perubahan waktu retensi yang signifikan dan dibuktikan dengan % RSD yang ≤ 2%.
5. Feni Agiyanti
Soal:
· Dapatkah analisis ini dengan metode yang lebih sederhana?
Jawaban:
· Dapat, seperti UV-VIS, namun harus dipisahkan terlebih dahulu dan tidak bisa dilakukan secara simultan.
Soal:
· Manakah yang terelusi lebih dulu?
Jawaban:
· Pada metode HPLC, AMOX akan terelusi lebih dahulu.
6. Anggia Devi CA
Soal:
· Mengapa detektor yang digunakan UV bukan yang lain?
Jawaban:
· Detektor UV digunakan karena senyawa-senyawa yang dideteksi memiliki gugus kromofor.
Soal:
· Adakah detektor lain yang dapat digunakan? Sebutkan apa dan mengapa?
Jawaban:
· Ada, detektor elektrokimia karena ada gugus yang bisa direduksi atau dioksidasi. Namun tidak diketahui apakah efektif atau tidak.
7. Fini Lafiani
Soal:
· Pada persen kadar yang diperoleh, didapat bahwa kadar untuk AMOX dan BROM
> 100%. Mengapa bisa seperti itu?
Jawaban:
· Pengujian kadar kapsul digunakan untuk mengetahui apakah tiap kapsul benar mengandung 125 mg AMOX dan 4 mg BROM seperti yang tertera pada label obat. Namun ternyata setelah diteliti ternyata ada kapsul yang mengandung AMOX 127,44 mg dan BROM 4,03 mg sehingga kadarnya lebih dari 100 %. Ini menunjukkan bahwa kadar yang tertera pada label tidak selamanya akurat.
8. Alma Amelia
Soal:
· Apakah bisa digunakan metode lain misalnya UV-VIS atau AAS? Mengapa demikian? Hal apa yang mendasarinya? Apa perbandingannya?
Jawaban:
· Metode UV bisa digunakan namun harus dilakukan pemisahan terlebih dahulu. Metode VIS tidak bisa digunakan karena AMOX dan BROM bukan merupakan senyawa berwarna sehingga jika menggunakan metode ini harus direaksikan dulu dengan senyawa atau zat lain untuk membentuk kompleks berwarna.
Metode AAS tidak bisa digunakan karena senyawa yang akan diidentifikasi tidak mengandung logam. Sehingga lebih dianjurkan menggunakan HPLC untuk mengatasi masalah tersebut.
9. Dita Yulia Eka P
Soal:
· Mengapa fasa gerak yang digunakan metanol? Apakah bisa diganti dengan etanol?
Jawaban:
· Pada penentuan AMOX dan BROM dalam kapsul Bromolin-250 lebih dipilih metanol dengan amonium asetat karena kombinasi fasa gerak ini merupakan kombinasi yang paling cocok. Bisa saja diganti dengan etanol, hal ini akan menyebabkan fasa gerak menjadi sedikit lebih non polar jika dibandingkan dengan metanol. Dengan demikian, dikhawatirkan AMOX akan lebih lama terelusi, sedangkan BROM tidak terlalu lama tertahan di fasa diam sehingga dapat menyebabkan pemisahan yang kurang efisien atau tumpang tindih.
Soal:
· Bagaimana jika parameter operasionalnya mengalami perubahan besar? Apakah menyebabkan perubahan waktu retensi?
Jawaban:
· Perubahan kecil pada parameter operasionalpun sebenarnya menyebabkan perubahan waktu retensi, namun tidak terlalu signifikan. Jadi, jika parameter operasionalnya diubah dalam rentang yang besar, maka akan mengakibatkan perubahan waktu retensi yang sangat signifikan.
10. Gita Maharani
Soal:
· Pelarut yang digunakan campuran metanol : amonium asetat atau hanya salah satu misalnya metanol saja?
Jawaban:
· Pelarut yang digunakan adalah campuran metanol : amonium asetat dengan rasio (90:10)
11. Putri Nuristi
Soal:
· Mengapa hubungan linier antara luas puncak terhadap konsentrasi dapat diamati selama rentang 100-300 mg/ml untuk AMOX?
Jawaban:
· Karena pada rentang tersebut diperoleh linieritas yang dinyatakan sebagai koefisisen korelasi (R2) sebesar 0,993. Jika diluar rentang tersebut tidak bisa dipastikan bahwa kurva akan tetap linier atau tidak.
12. Pipit Siti Latifah
Soal:
· Apa kelemahan dari metode ini?
Jawaban:
· Kelemahan metode HPLC adalah harga alat yang cukup mahal
Soal:
· Kenapa kedua zat bisa dianalisis secara bersamaan?
Jawaban:
· Inilah salah satu kelebihan HPLC, dapat menganalisis senyawa secara bersamaan atau simultan tanpa harus dipisahkan dulu seperti pada metoda UV.
13. Jeli Farina
Soal:
· Kenapa panjang gelombang yang dipilih 254 nm?
Jawaban:
· Pada analisis kedua senyawa ini dipilih pada panjang gelombang 254 nm karena kedua senyawa ini merupakan senyawa organik dimana hampir semua senyawa organik bisa dideteksi pada panjang gelombang tersebut. Penyebab lain adalah keterbatasan alat HPLC yang ada biasanya sudah di set pada panjang gelombang tersebut.
Komentar
Posting Komentar